Выделение и химическая характеристика полисахаридов (вибурнанов) из шрота ягод калины обыкновенной Viburnum opulus

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Биология
Узнать стоимость новой

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Химия растительного сырья. 1999. № 1. С. 53−57
ВЫДЕЛЕНИЕ И ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИСАХАРИДОВ (ВИБУРНАНОВ) ИЗ ШРОТА ЯГОД КАЛИНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ VIBURNUM OPULUS
© Р. Г. Оводова, В. В. Головченко, С.В. Попов
Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, Сыктывкар (Россия)
E-mail: ovoys@iph. komi. ru
Авторы выражают глубокую благодарность за поддержку данного исследования грантами РФФИ (грант № 96−04−49 641) и Научного совета: «Химия и технология переработки растительного сырья» (грант № 96−22).
Из шрота ягод калины обыкновенной Viburnum opulus последовательной экстракцией водой при разных температурах и рН и водным оксалатом аммония выделены полисахариды (вибурнаны), которые были очищены ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Гомогенность очищенных вибурнанов определена гельфильтрацией на сефакриле S-500. Установлено, что выделенные водной экстракцией вибурнаны представляют собой кислые араби-ногалактаны, в состав которых входят остатки гликуроновых кислот, а полисахариды, выделенные при обработке подкисленной водой (рН 4. 0) и водным оксалатом аммония являются смесью кислых арабиногалактанов, возможно, пектинов и нейтральных галактоманнанов. Показано, что ряд вибурнанов стимулирует фагоцитарную активность лейкоцитов.
Введение рины, аскорбиновая кислота [6, С. 42−45]. В то же
Калина обыкновенная Viburnum opulus L. из семейства Caprifoliaceae издавна использовалась в народной медицине как высокоэффективное средство для лечения многих заболеваний: воспаления верхних дыхательных путей, язвы желудка, кровотечений, фурункулеза, истерии [1, С. 93, 94], рака молочной железы, кандидозного стоматита у детей, псориаза, менорагий, васкулитов, импетиго, авитаминозов- рекомендуется людям, находящимся в условиях радиоактивного излучения и проживающим на территории, зараженной радионуклидами [2, С. 270].
время данные о строении и биологической активности полисахаридов практически полностью отсутствуют.
Данная работа посвящена выделению из плодов калины полисахаридных фракций, их характеристике и определению физиологической активности. Для полисахаридов калины мы предлагаем общее название «вибурнаны».
Обсуждение результатов
В плодах калины был обнаружен ряд низкомолекулярных соединений: флавоноиды — астрага-лин, аментофлавон, пеонозид, которые относятся к группе «витамина Р» [3]- антоцианы — цианидин, мальвинидин [4, С. 73, 74]- шесть тритерпеноидов [5]- филохинон, органические кислоты, фитосте-
Для выделения вибурнанов был использован обезжиренный органическими растворителями шрот ягод калины обыкновенной Viburnum opulus. Извлечение полисахаридов было достигнуто последовательной экстракцией сырья водой при 20 и 70 °C, подкисленной водой (рН 4. 0, 70°С) и 0. 7%-ным водным оксалатом аммония при 68 °C. Схема выделения представлена на рисунке 1, характеристика выделенных фракций дана в таблице 1.
Таблица 1
Характеристика вибурнанов из шрота Viburnum opulus
Содержание, %*
Вибурнаны Выход %* гликуроновых кислот белка моносахаридов
Rha Ara Xyl Man Glc Gal
VO1 2.0 21.3 34.4 сл 6.0 2.4 сл 3.0 8. 9
VO2 0.5 34.0 23.6 сл 7.2 сл 4.8 3.5 12. 7
VO3 0.8 22.0 7.0 сл 7.9 сл 35.9 2.7 18. 1
VO4 1.9 63.0 15.0 сл 5.0 сл 14.0 сл 11. 4
сл — следовые количества.
* - выход от воздушно-сухого сырья.
отход
Рис. 1. Схема выделения вибурнанов
Таблица 2
Характеристика вибурнанов из шрота Viburnum opulus после разделения на ДЭАЭ-целлюлозе
Содержание, %*
Вибурнаны Выход %* гликуроновых кислот белка моносахаридов
Rha Ara Xyl Man Glc Gal
VO1−1 34.5 14.0 12.0 сл 12.0 2.3 3.0 сл 11. 4
VO2−1 34.2 37.0 10.0 8.7 8.7 сл сл сл 10. 7
VO3−1 8.5 2.0 0 сл сл сл 47.3 2.8 4. 9
VO3−2 21.5 66.0 4 сл 3.4 сл сл сл 8. 7
VO4−1 2.7 3.0 6.0 сл сл сл 48.6 сл 5. 9
VO4−2 46.0 48.8 4.2 сл сл сл сл сл 8. 4
— следовые количества.
* - выход от воздушно-сухого сырья.
Ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе (ОН--форма) получены индивидуальные вибурнаны, гомогенность которых установлена гельфильтрацией на сефакриле S-500. При очистке вибурнана VO1 ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе была выделена одна полисахаридная фракция — вибурнан VO1−1, который представляет собой кислый полисахарид, содержащий остатки гликуроновой кислоты. При делении VO2 выделена также одна фракция кислого полисахарида: вибурнана VO2−1.
При кислотном гидролизе с дальнейшим определением моносахаридного состава полисахарида методом бумажной хроматографии (БХ) и газожидкостной хроматографии (ГЖХ) в виде ацетатов полиолов [7] показано, что полисахариды VO1−1 и VO2−1 в основном состоят из арабинозы и галактозы (молярное отношение 1: 1, 1:2 соответственно) и гликуроновой кислоты (табл. 2). Установлено, что вибурнаны VO3 и VO4 представляют собой смесь двух полисахаридов: нейтральных галактоманнов — вибурнанов VO3−1, VO4−1 (молярное отношение галактозы к маннозе составляет 1: 10 и 1:8 соответственно) и кислых арабиногалактанов — вибурнанов VO3−2 и VO4−2, содержащих остатки гликуроновой кислоты, ара-бинозы и галактозы (c молярным отношением двух последних 1:3 в обеих фракциях). В состав всех фракций входят в минорных количествах
остатки рамнозы, ксилозы, глюкозы (табл. 2), при фракционировании на ДЭАЭ-целлюлозе удалось избавиться от части несвязанного с полисахаридом белка.
Исследование физиологической активности полисахаридных фракций показало, что вибурна-ны VO3 и VO4, а также очищенные полисахариды — вибурнаны VO3−1, VO3−2, VO4−1, VO4−2 усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови человека и макрофагов брюшной полости крыс, а арабиногалактаны (ви-бурнаны VO1 и VO2) не проявляют активности в отношении фагоцитарных клеток.
Экспериментальная часть
Растительный материал
Шрот ягод калины обыкновенной, полученный после предварительной обработки петролейным эфиром и метиловым спиртом, любезно предоставлен сотрудниками Института органической химии УНЦ РАН (Уфа).
Общие аналитические методы
Общее содержание гликуроновых кислот определяли по реакции с концентрированной серной кислотой и 2,3-диметилфенолом [8], белка — по методу Лоури [9]. Спектрометрические измерения проводились на приборе СФ-26.
Бумажную хроматографию проводили на бумаге Fiftm FN-13 нисходящим методом в системе
н-бутанол-пиридин-вода (объемные соотношения 6: 4:3 соответственно). Идентификацию моносахаридов осуществляли с помощью кислого анилин-фталата при 105 °C.
Газожидкостную хроматографию проводили на хроматографе Hewlett-Packard 4890A с пламенно-ионизационным детектором, капиллярной колонкой RTX-1 (0. 25 мм 0×30 м), газ-носитель -Не, сброс 1: 60. Температурный режим: 175 °C (1 мин) ^ 250 °C (2 ми), А 3°/мин.
Все растворы упаривали в вакууме при 40 °C.
Выделение вибурнанов
Схема выделения вибурнанов представлена на рисунке 1. Шрот ягод калины (100 г), предварительно обработанный органическими растворителями, измельчали и дважды экстрагировали дис-тилированной водой при комнатной температуре в течение 3 ч. Контроль экстракции осуществляли с помощью фенол-серного метода [8], проводя экстракцию до отрицательной реакции. Остаток сырья отделяли центрифугированием. Экстракты объединяли и концентрировали, полисахариды осаждали тройным объемом этилового спирта, осадок отделяли центрифугированием, растворяли в воде, диализовали против дистилированной воды и лиофилизовали. Выделили вибурнан VO1 с выходом 2. 0%.
Остаток сырья заливали дистилированной водой, смесь нагревали при 700С в течение 3 ч при непрерывном перемешивании. Экстракцию повторяли до отрицательной реакции на содержание углеводов в экстракте [8]. Экстракты обрабатывали, как описано выше. В результате выделили ви-бурнан VO2 с выходом 0. 5%.
Остаток сырья заливали водой (рН 4. 0), подкисленной соляной кислотой, смесь нагревали при 70 °C в течение 3 ч при непрерывном перемешивании. Экстракцию проводили до отрицательной реакции на содержание углеводов в экстракте [8]. Экстракты обрабатывали, как описано выше. В результате выделили фракцию VO3 с выходом
0. 8%.
Остаток сырья заливали 0. 7%-ным водным раствором оксалата аммония (68°С, 3 ч). Экстракцию проводили до отрицательной реакции на содержание углеводов в экстракте [8]. Экстракты обрабатывали по вышеописанной методике. В результате выделили вибурнан VO4 с выходом 1. 9%.
Получение гомогенных вибурнанов
Для очистки выделенных полисахаридных фракций использовали ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе (ОН-- форма), гомогенность полученных вибурнанов определяли с помощью гельфильтрации на сефакриле S-500.
Растворы фракций VO1-VO4 (150−200 мг) наносили на колонку (35×3 см) с ДЭАЭ-целлюлозой (ОН--форма) и элюировали 0. 01−0.5 и 1 М NaCl (скорость 46 мл/ч). Собирали фракции (14мл), которые регистрировали на хроматографической системе «Uvicord SII» при 206 нм. Объединенные растворы диализовали, упаривали и лиофилизова-ли. Получили вибурнаны VO1−1, VO2−1, VO3−1, VO3−2, VO4−1, VO4−2.
Полученные вибурнаны (50−60 мг) наносили на колонку (40×1.5 см) с сефакрилом S-500 и элюировали 0.1 М NaCl, осуществляя контроль по фенол-серному методу [8]. Во всех случаях наблюдали по одному пику на выходных кривых, что указывает на гомогенность вибурнанов.
Кислотный гидролиз вибурнанов
Полисахариды (5 мг) нагревали с 2 М трифто-руксусной кислотой (1 мл), содержащей мио-инозит (1 мг), кислоту удаляли многократным упариванием с метанолом. Моносахариды идентифицировали БХ и ГЖХ в виде соответствующих ацетатов полиолов [7].
Выводы
1. Из шрота ягод калины обыкновенной Viburnum opulus последовательной экстракцией водой при 20 °C и 70 °C, а также подкисленной водой (рН 4. 0) при 70 °C и 0. 7%-ным водным оксалатом аммония при 700С выделены четыре полиса-
харидных фракции (вибурнаны VO1-VO4 соответственно). Полученные вибурнаны очищены ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе (ОН--форма), гомогенность очищенных вибурна-нов показана с помощью гельфильтрации на се-факриле S-500.
2. Установлено, что вибурнаны VO1 и VO2, представляют собой кислые арабиногалактаны содержащие остатки гликуроновых кислот, а ви-бурнаны VO3 и VO4 — смесь нейтрального галак-томаннана и кислого арабиногалактана. Природа гликуроновых кислот не установлена.
3. Найдено, что вибурнаны VO1, VO2 (ара-биногалактаны) не проявляют активности в отношении фагоцитарных клеток, а вибурнаны VO3, VO4 и те же вибурнаны после фракционирования на ДЭАЭ-целлюлозе усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови человека и макрофагов брюшной полости крыс.
Список литературы
1. Мингалева В. Г. Лекарственные растения Сибири. Новосибирск, 1 970. 270 c.
2. Растительные ресурсы России и сопредельных государств / Отв. ред. А. Л. Буданцев. Доп. к 1−7 т. Спб., 1 996. 571 с.
3. Шатро Д. К., Кисшевьский I.P., Мороз А. П., Василевська T. I, Горбацевич B.I., Примиц М. П., Вереськовский В. В. Бюлопчно активш речовини плод1 В перспективних форм калини звичайно1 // Фармацевт. журн. 1989. № 1. С. 55−58.
4. Губанов И. А. Лекарственные растения: Справочник. М., 1993. 272 с.
5. Machida K., Kikuchi M. Studies on the constituents of Viburnum Species. Vibumans: Six new triterpenoids from Viburnum dilatatum // Chem. Pharm. Bull. 1997. Vol. 45. Р. 1928−1931.
6. Лавренова Г. В. Фитотерапия. Спб., 1996. Т. 2. 480 с.
7. York W.S., Darvill A.G., McNeil M., Stevenson T.T., Albersheim P. Isolation and characterization of plant cell walls and cell-wall components // Meth. Enzymol. 1985. Vol. 118. Р. 3−40.
8. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., and Smith F. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances // Analyt. Chem. 1956. Vol. 28. Р. 350−356.
9. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., and Randall R.J. Protein measurement with the Fholin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265−275.
Поступило в редакцию 24. 11. 98

Показать Свернуть
Заполнить форму текущей работой